Verschil tussen Sanger Sequencing en Pyrosequencing | Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Belangrijkste verschil - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
DNA sequencing is erg belangrijk voor DNA analyse, aangezien kennis van de juiste nucleotidenopstelling op een bepaald DNA-gebied onthult veel belangrijke informatie daarover. Er zijn verschillende DNA sequencing methoden. Sanger sequencing en Pyrosequencing zijn twee verschillende DNA sequencing methodes die veel gebruikt worden in Moleculaire Biologie. Het belangrijkste verschil tussen Sanger sequencing en Pyrosequencing is dat Sanger sequencing gebruik maakt van dideoxynucleotiden om de synthese van DNA te beëindigen om de nucleotidesequentie te lezen, terwijl pyrosequencing de pyrofosfaatvrijstelling detecteert door de nucleotiden te integreren en de complementaire sequentie te synthetiseren om de exacte volgorde van de volgorde.
INHOUD
1. Overzicht en sleutelverschil
2. Wat is Sanger Sequencing
3. Wat is Pyrosequencing
4. Side by Side Vergelijking - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
5. Samenvatting
Wat is Sanger Sequencing?
Sanger sequencing is een eerste generatie DNA sequencing methode ontwikkeld door Frederick Sanger en zijn hogescholen in 1977. Het staat ook bekend als Chain Termination Sequencing of Dideoxy sequencing aangezien het gebaseerd is op ketenterminatie door dideoxynucleotiden (ddNTPs). Deze methode werd al ruim 30 jaar veel gebruikt tot de New Generation Sequencing (NGS) werd ontwikkeld. Sanger sequencing techniek zorgde voor de ontdekking van de juiste nucleotide volgorde of de binding van een bepaald DNA fragment. Het is gebaseerd op de selectieve incorporation van ddNTPs en de beëindiging van DNA synthese tijdens de in vitro DNA replicatie. De afwezigheid van 3'H-groepen om fosfodiesterbindingvorming tussen aangrenzende nucleotiden voort te zetten is een uniek kenmerk van ddNTPs. Als zodra de ddNTP is aangesloten, stopt de kettingverlenging en eindigt vanaf dat punt. Er zijn vier ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP en ddTTP - gebruikt in Sanger sequencing. Deze nucleotiden stoppen met het DNA-replicatieproces wanneer ze zijn opgenomen in de groeiende DNA-streng en resulteren in verschillende lengtes van kort DNA. Capillaire gelelektroforese wordt gebruikt om deze korte DNA-strengen te organiseren volgens hun maten op een gel, zoals getoond in Figuur 01.
Figuur 1: Capillaire gelelektroforese van gesynthetiseerd kort DNA
Voor in vitro replicatie van DNA, zouden weinig eisen moeten worden verstrekt. Zij zijn DNA polymerase enzym, template DNA, oligonucleotide primers en deoxynucleotiden (dNTPs). Bij Sanger-sequencing wordt DNA replicatie uitgevoerd in vier aparte proefbuizen samen met vier typen ddNTP's afzonderlijk. Deoxynucleotiden worden niet volledig vervangen door de respectieve ddNTP's. Een mengsel van het bepaalde dNTP (bijvoorbeeld dATP + ddATP) is in de buis opgenomen en gerepliceerd. Vier afzonderlijke buisproducten worden gelopen in een gel in vier aparte putten. Vervolgens kunt u de sequentie opbouwen zoals getoond in figuur 02.
Figuur 02: Sanger sequencing
Sanger sequencing is een belangrijke techniek die helpt op veel gebieden van moleculaire biologie. Menselijk genoom project is succesvol afgerond met behulp van Sanger sequencing-gebaseerde methoden. Sanger-sequencing is ook handig bij het bepalen van DNA-sequencing, onderzoek naar kanker en genetisch ziekte, genuitdrukkingsanalyse, identificatie van mensen, pathogeen detectie, microbiële sequencing etc.
Er zijn verscheidene nadelen van Sanger-sequencing:
- De lengte van het DNA dat sequenced kan niet langer zijn dan 1000 basisparen
- Er kan slechts één streng op een keer worden gesorteerd.
- Het proces is tijdrovend en duur.
Daarom werden nieuwe geavanceerde sequencing technieken ontwikkeld met de tijd om deze problemen te overwinnen. Sanger sequencing is echter nog steeds in gebruik vanwege de zeer nauwkeurige resultaten tot ongeveer 850 basisparen lengte fragmenten.
Wat is Pyrosequencing?
Pyrosequencing is een nieuwe DNA sequencing techniek gebaseerd op de "sequencing by synthesis". Deze techniek berust op de detectie van pyrofosfaatvrijstelling bij de nucleotide-opname. Het proces wordt gebruikt door vier verschillende enzymen: DNA polymerse, ATP sulfurylase, luciferase en apyrase en twee substraten adenosine 5 'fosfosulfate (APS) en luciferine.
Het proces begint met de primerbinding met de enkelstrengs DNA-sjabloon en DNA-polymerase begint de integratie van nucleotiden die complementair zijn. Wanneer de nucleotiden samenvoegen (nucleïnezuurpolymerisatie), laat het pyrofosfaat (twee samengestelde fosfaatgroepen) groepen en energie vrij. Elke nucleotide-toevoeging maakt de equimolaire hoeveelheid pyrofosfaat vrij. Pyrofosfaat omzetten in ATP door ATP sulfurylase in aanwezigheid van substraat APS. De gegenereerde ATP stuurt de luciferase-gemedieerde omzetting van luciferine naar oxyluciferine, waardoor zichtbaar licht wordt verkregen in hoeveelheden die evenredig zijn aan de hoeveelheid ATP's. Licht wordt gedetecteerd door een foton detectie apparaat of door fotomultiplicator en maakt een pyrogram. Apyrase degradeert ATP en niet-geïncorporeerde dNTP's in het reactiemengsel. dNTP-toevoeging wordt één keer per keer uitgevoerd. Aangezien de toevoeging van nucleotide bekend is volgens de opname en detectie van licht, kan de sequentie van het sjabloon worden bepaald.Pyrogramma wordt gebruikt voor het genereren van de nucleotidesequentie van het monster-DNA, zoals getoond in Figuur 03.
Pyrosequencing is zeer belangrijk bij het analyseren van enkel nucleotide polymorfisme en sequentiebepaling van korte strektjes DNA. De hoge nauwkeurigheid, flexibiliteit, gemak van automatisering en parallelle verwerking zijn de voordelen van pyrosequencing over Sanger sequencing technieken.
Figuur 03: Pyrosequencing
Wat is het verschil tussen Sanger Sequencing en Pyrosequencing?
- diff Artikel Midden voor Tabel ->
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
|
| Sanger sequencing is een DNA sequencing methode gebaseerd op de selectieve incorporation van ddNTPs door DNA polymerase en keten beëindiging. | Pyrosequencing is een DNA sequencing methode gebaseerd op de detectie van pyrofosfaat vrijlating bij de opname van nucleotide. |
| Gebruik van ddNTP | |
| ddNTPs worden gebruikt om de DNA replicatie te beëindigen | ddNTPs worden niet gebruikt. |
| betrokken enzymen | |
| DNA polymerase worden gebruikt. | Vier enzymen worden gebruikt: DNA polymerase, ATP sulfurylase, Luciferase en Apyrase. |
| Substraten gebruikt | |
| APS en Luciferine worden niet gebruikt. | Adenosine 5 'fosfosulfate (APS) en luciferine worden gebruikt. |
| Maximum Temperatuur | |
| Dit is een langzaam proces. | Dit is een snel proces. |
Samenvatting - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger sequencing en Pyrosequencing zijn twee DNA sequencing methoden gebruikt in moleculaire biologie. Sanger sequencing bouwt de volgorde van de nucleotiden in volgorde door de kettingverlenging te beëindigen, terwijl de pyrosequentie de precieze volgorde van de nucleotiden in opeenvolging construeert door integratie van nucleotiden en het detecteren van de afgifte van pyrofosfaten. Daarom is het belangrijkste verschil tussen Sanger sequencing en Pyrosequencing dat Sanger sequencing werkt op sequencing door ketenterminering, terwijl pyrosequencing werkt op sequencing door synthese.
Referentie:
1. Fakruddin, Md, en Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-een alternatief voor traditionele Sanger Sequencing. "Amerikaans Journal of Biochemistry and Biotechnology. Wetenschap Publicaties, 02 maart 2012. Web. 28 februari 2017.
2. "Sanger sequencing. "Sanger sequencing - ScienceDirect Onderwerpen. N. p., n. d. Web. 28 februari 2017
Image Courtesy:
1. "Didesoxy-Methode" Door Christoph Goemans (Modifiziert) - Dr. Norman Mauder, op basis van Christoph Goemans (CC BY-SA 3. 0) via Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-seq" Door Enzo in de Poolse taal Wikipedia (CC BY-SA 3. 0) via Commons Wikimedia
3. "Pyrosequencing" door microbiologiebytes (CC BY-SA 2.0) via Flickr
